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课件网) 第二节 基因工程的基本操作程序 苏云金杆菌 与载体拼接 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达Bt基因 导入 Bt基因 重组DNA分子 培育转基因抗虫棉的简要过程 问题探讨 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 目的基因 受体细胞 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 第一步：目的基因的筛选与获取 什么是基因 基因通常是有遗传效应的DNA片段 基因定义： 基因片段 非基因片段 原核生物的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游：启动子 编码蛋白质，连续不间断 编码区下游：终止子 真核生物的基因结构 非编码区 编码区 非编码区 外显子：编码蛋白质 内含子：不编码蛋白质 初级转录产物 成熟mRNA 剪接 mRNA 逆转录 cDNA 无剪接过程 第一步：目的基因的筛选与获取 一、目的基因 （1）概念： 用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因； 与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。（Bt抗虫蛋白基因）。 主要是编码特定蛋白质的基因 （2）实例： 如何筛选目的基因 用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史 苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关 掌握了Bt基因的序列信息 对Bt基因的表达产物--对Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解 Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因 二、筛选合适的目的基因 第一步：目的基因的筛选与获取 方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。 二、筛选合适的目的基因 DNA测序仪 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 美国国家生物信息中心 第一步：目的基因的筛选与获取 随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为科学家找到合适的目的基因提供更多机会和可能。 目的基因如何获取 第一步：目的基因的筛选与获取 三、目的基因的获取 方法： 1.人工合成 2. PCR获取和扩增目的基因 3. 构建基因文库（p82） 基因组文库 cDNA文库 基因文库：把某种生物基因DNA通过酶切获得大量DNA片段，然后将这些片段与载体连接，再转入受体菌中，这样整个菌群克隆就包含该生物的全部基因片段，称为基因文库。 PCR技术 第一步：目的基因的筛选与获取 聚合酶链式反应，根据DNA半保留复制的原理，在体外（PCR扩增仪）提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 概念： 体外模拟DNA复制，实现快速扩增DNA PCR扩增仪 第一步：目的基因的筛选与获取 DNA复制所需的基本条件： 参与组分 在DNA复制中的作用 解旋酶（体外用高温代替） DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 提供DNA复制的模板 打开DNA双链 使DNA聚合酶能够从引物的3`端开始连接脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 DNA聚合酶不能直接发起子链的合成，只能催化单个核苷酸加到3`端而延伸子链 什么是引物？ 第一步：目的基因的筛选与获取 PCR反应体系中有哪些必需的物质： DNA模板 2种引物 原料： 耐高温的DNA聚合酶 Mg+ ： 激活DNA聚合酶 有两条模板链 四种脱氧核苷酸 PCR扩增的过程： 1.目的基因DNA受热变性后解为单链（解旋） 变性 2.引物与单链相应互补序列结合 3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下延伸，即将四种脱氧核苷酸加到引物的3`端。 复性 延伸 PCR反应过程示意图： 第一轮循环：（每次循环分为变性、复性、和延伸三步。） 变性：解旋 PCR反应过程示意图： 第一轮循环：（每次循环分为变性、复性、和延伸三步。） 复性的过程只有引物与DNA模板链结合吗？ 不一定，也存在解开的两条DNA单链的结合， 原因：①引物较短，更容易结合；②引物量多，引物与模板 ... ...
