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课件网) 专题精研课12 PCR技术中引物的拓展应用 应用一 利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤,可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中,PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因,还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。 专项突破 1.(2024·山东青岛期末)某研究小组构建了能表达ACTA1—GFP融合蛋白的重组质粒,该重组质粒的部分结构如下图所示。下列叙述错误的是( ) 注:F1和F2表示上游引物,R1和R2表示下游引物。 A.RNA聚合酶与启动子结合,调控ACTA1基因和GFP基因的表达 B.使用F2和R2一对引物,可以确定ACTA1基因插入方向是否正确 C.ACTA1基因转录的模板链是a链,引物F1与b链的部分序列相同 D.为了减少PCR中非特异性条带的产生,可以适当升高复性的温度 B 解析 据图可知,ACTA1基因和GFP基因位于启动子和终止子之间,故RNA聚合酶与启动子结合,调控ACTA1基因和GFP基因的表达,A项正确;据图可知,引物F1、R2或F2、R1结合部位包含ACTA1基因的碱基序列,因此推测为了确定ACTA1基因连接到质粒中且插入方向正确,进行PCR检测时,若用一对引物,应选择图中的引物F1、R2或F2、R1,B项错误;ACTA1基因转录的模板链是a链,引物F1与b链均可以和a链互补配对,二者部分序列相同,C项正确;非特异条带增加的原因可能是复性温度过低,造成引物与模板的结合位点增加,故可通过提高复性的温度来减少反应中非特异性条带的产生,D项正确。 应用二 利用PCR技术引导基因定点突变 重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上,采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,通过重叠链的延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。 专项突破 2.(2024·福建福州期末)通过设计引物,运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。下图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是( ) A.在该PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、解旋酶、耐高温的DNA聚合酶等 B.第2轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因 C.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体 D.第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA分子占1/2 答案 C 解析 PCR反应体系中还需要加入4种游离的脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶,直接利用高温解旋,不需要加解旋酶,A项错误;第3轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因,B项错误;引物中设计两种限制酶识别位点,可以配合载体的限制酶识别位点,帮助目的基因定向定点插入运载体,避免发生自身环化,C项正确;第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个,而子代DNA有23=8个,故含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4,D项错误。 应用三 利用PCR技术扩增未知基因序列 利用PCR技术进行基因扩增时,为了便于设计引物,要求目的基因两侧的序列是已知的。当DNA的某些序列已知,而需要扩增已知序列两端的未知序列时,可采用反向PCR技术。 专项突破 3.(2024·广西南宁二模)常规PCR只能扩增两引物之间的DNA序列,要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列,可用反向PCR技术。反向PCR 技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是( ) A.酶切阶段,L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列 B.环化阶段,可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶 C.图 ... ...
